当今临床诊治实践对HBV检验试剂性能的新要求

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作者:杨瑞锋副研究员

单位:北京大学人民医院,北京大学肝病研究所

从上个世纪中叶到现在,HBV感染对我们人民的健康造成了极大的危害。 HBV感染引起的慢性乙型肝炎仍是我国肝硬化和肝细胞癌的罪魁祸首。自20世纪90年代以来,中国已开始将HBV疫苗纳入计划免疫管理。感染率迅速下降,并从高HBV流行病转变为中等流行率。 HBsAg血清阳性率已降至5%以下,但其余部分仍然存在。有很多人在谈论HBV变色。

HBV具有复杂而复杂的基因组结构和蛋白质表达调控系统。共价闭合环状DNA(cccDNA)是病毒的“老巢”。感染后,进入肝细胞核,转录4种mRNA,编码9种病毒蛋白(HBsAg,HBeAg,HBcAg,逆转录酶等),逆转录酶合成HBVDNA。整个过程非常复杂[1]。 (图1部分引用[1]并授权)。目前的抗病毒药物可以抑制但不能根除cccDNA,cccDNA被认为是慢性乙型肝炎未治愈的根本原因。

一、距离世界卫生组织(WHO)提出的2030年“全面消除病毒性肝炎”目标有多远?

世界卫生组织提出的目标非常雄心勃勃,但唯一剩下的就是只剩下10年了。面对中国仍有大量HBV感染人群和慢性乙型肝炎患者(约1亿人),要实现这一目标,首先要加强HBV。感染筛查,其次,需要科学有效的治疗。

目前,我们正处于新老乙肝治疗的前夕,各种新型靶向治疗药物层出不穷,但需要时间才能进入市场,同时注射长效干扰素和口服强效药物,低电阻核苷(酸)类似物仍然是当今的主流治疗方法,多年来一直没有突破。

今年7月28日,第九届世界肝炎日,如何在今天的治疗计划框架内充分利用HBV检测标记来指导药物选择和疗效预测,这与我们每个乙型肝炎患者有关。临床,科学和体外诊断技术人员的重要主题。

二、HBV血清和分子生物学标志物不断被“翻炒”凸显抗HBV治疗仍无革命性进展

近年来,抗病毒治疗中许多与HBV相关的“新”标记已经得到充分研究,其结果仍然出现在肝病等权威期刊上,如HBV前基因组RNA(pgRNA),核心相关抗原(HBcrAg)和核心抗体(HBcAb)。定量等反映出中国在乙型肝炎领域的研究水平已得到国际认可[2];然而。这些“新”指标越多,目前慢性乙肝治疗越突出,仍然没有取得直接抗病毒药物(DAA)治愈丙型肝炎等革命性突破,因此我们只能继续“深入培育”原始模式,希望在有限的空间内检测更复杂的标记组合,尝试进一步优化现有的治疗方案。

例如,pgRNA和HBcrAg理论上可用于指示口服抗病毒药物的提取。然而,由于一线口服药物(如恩替卡韦)的价格迅速下降,长期治疗的经济负担几乎可以忽略不计,因此这些用于预测。退出指标的检测需求也将受到影响。

三、HBV感染诊断和治疗相关的几个核心检验指标地位依然稳固

慢性乙型肝炎的抗病毒诊断和治疗的最核心指标是众所周知的乙型肝炎“两个半”和HBV DNA。严格来说,“乙型肝炎”和“两个半”不是技术术语,但为了公众理解,这些标题仍然在本文中使用。

1、HBsAg、HBVDNA和HBcAb是最重要的HBV感染筛查标志物

HBsAg是我们最熟悉的筛查标记,但其敏感性有一些局限性。近年来,中国逐渐实现了在血站中使用高灵敏度HBsAg(如使用基于化学发光的试剂)和HBVDNA试剂来筛选献血者。 HBV DNA检测的引入可以通过献血进一步降低HBV感染(OBI)和HBV急性乙型肝炎传播的风险。

OBI被定义为现有敏感试剂检测HBsAg为“阴性”,但存在松散的环状DNA(rcDNA,即一般的HBV DNA)或肝细胞中具有完整复制活性的cccDNA,或者可以在血清中检测到。然而,对于HBV DNA,血清DNA倾向于极低(<200IU/mL)[3,4]。大多数OBI血清HBcAb是阳性的,但也存在血清学阴性的OBI。

HBcAb不是保护性抗体,也不是先前或当前感染的阳性指标。在美国HBV感染率较低的国家,HBcAb阳性血液不能用于输血或血液制品,主要是因为担心HBcAb阳性的OBI供体。在中国,由于HBcAb在一般人群中的患病率高达30-40%,因此不排除HBcAb阳性献血者。

在临床实践中,HBcAb阳性患者,如果免疫系统正常,一般不需要特殊治疗,但患者是造血干细胞或实体器官移植受者,或需要接受抗因肿瘤,胃肠道,风湿病或皮肤病如果CD20,抗TNF,长期类固醇或其他免疫抑制剂,或全身性癌症化疗,应分为高,中,低风险的HBV再激活组,积极监测病毒指标并在必要时启动。预防性抗病毒治疗可避免HBV再激活引起的肝损伤[5]。

2、HBsAg、HBeAg和HBVDNA指示慢乙肝抗病毒治疗的三个“终点”的标志物

以目前主流的口服抗HBV药物治疗为例,更容易抑制病毒复制,使HBV DNA阴性,这是慢性乙型肝炎治疗的基本终点; HBeAg变为阴性(即“大三阳”变成“小三阳”)这是一个令人满意的终点; HBsAg阴性和/或HBsAb的产生是理想的终点。但不幸的是,只有少数患者可以达到理想的终点。这些标志物的组合可以帮助临床选择治疗选择(干扰素或口服),确定抗病毒治疗的功效,并调整治疗选择。

四、HBV血清学标志物(“两对半”)应和HBVDNA一样,实现“定量”检测[6]

1、HBsAg定量(qHBsAg)应尽快推广

qHBsAg定量比HBV DNA更准确地反映cccDNA活性,以及免疫系统清除HBV的能力。

如前所述,cccDNA是HBV蜱的“老巢”,cccDNA是微观的,这意味着HBV感染趋于受到控制。 qHBsAg比HBV DNA更准确地反映了cccDNA的数量和活性[7]。同时,qHBsAg也反映了人体免疫系统对病毒抗原的控制。水平越高,对照越弱,甚至免疫耐受,导致感染。扩展;反之亦然。

qHBsAg有重要的临床预测价值

qHBsAg的预测价值首先是HBV感染的自然进展(即没有治疗干预),可以帮助确定感染阶段(高复制,免疫清除或无活性?),可以帮助预测疾病进展和结果(肝硬化和肝细胞癌的风险是多少?)它也可用于预测HBsAg清除率为。它可以简单地理解为:qHBsAg越低越好。

其次,在抗病毒治疗期间,qHBsAg有助于选择治疗方案并预测治疗反应。可以很容易地理解为治疗前qHBsAg水平越低,治疗越快,疗效越好。

具体而言,对于长效干扰素治疗,qHBsAg检测是必要的,其“阴性预测值”更大。换句话说,如果在治疗半年后HBsAg没有显着降低,干扰素治疗必须降低qHBsAg水平。或者仍然是> IU/mL,表明干扰素疗效差,应停止干扰素治疗。

另一方面,口服药物治疗是抑制HBV DNA复制的主要目的,并且不会迫使qHBsAg迅速减少。然而,一旦发现qHBsAg在治疗期间显着降低,则表明效果良好。应鼓励患者继续治疗,不要轻易停药。 HBsAg持续稳定下降甚至可能表明HBsAg清除到令人满意的治疗终点,在这种情况下,qHBsAg的“阳性预测值”更大。

展望未来,许多中外制药公司都热衷于研究治疗HBV感染的药物,以及未来的一些新药。有可能完全克服HBV感染,清除HBsAg甚至清除cccDNA。可以想象,到那时,qHBsAg可能成为仍然需要监测的少数“治愈”指标之一。

HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb定量也有一定的临床意义

除HBsAg外,其他血清学标志物具有一定的临床意义,见表1。

表1HBV血清学标志物(除HBsAg)定量检测的临床意义

?目前市面上HBV血清学标志物定量的试剂概览

一些进口和国产试剂已经实现了血清学标志物的“完全定量”(表2),但临床应用需要进一步的临床研究,验证和推广。

表2当前市场主流的HBV定性或定量血清学标志物检验试剂概览

五、高敏HBVDNA检测方法临床重要性无可替代

1、各大肝病学会均推荐使用“高敏”HBVDNA检验试剂

目前,世界肝脏病学会建议使用HBV DNA检测试剂,检测限为10~12 IU/mL。这被认为对高灵敏度HBV DNA试剂很重要。

2、献血者供血中极微量的病毒(0.15IU/mLHBVDNA)即可导致传染

来自欧洲的一项大规模血站调查显示,如果在献血者的血液中检测到总共16个拷贝或3个IU(即0.8拷贝/mL或0.15 IU/mL)的HBV DNA,则接受者可以是感染。感染[10]。目前主流HBV DNA定性或定量检测试剂的灵敏度远不是这种敏感性。

然而,无论是否需要进一步的灵敏度,都需要考虑成本效益问题,并且还必须考虑极其敏感的试剂也更容易受到交叉污染和气溶胶污染。但无论如何,HBV是如此具有感染力,它进一步刷新了我们的感知,并且还提醒我们,只要测量结果准确,HBVDNA试剂可能不会太敏感。

3、诊断OBI和预防免疫缺损人群HBV再激活也需高灵敏HBVDNA试剂

HBV再激活主要发生在免疫系统缺陷,无活性的HBsAg携带者或OBI患者中。如前所述,OBI患者中的血清HBV DNA通常较低(<200IU/mL),并且诊断性OBI依赖于敏感的HBV DNA试剂。 HBV再激活的诊断也依赖于HBV DNA测试。 HBV再激活的定义并不完全一致,但它是相似的。如果HBV DNA的基线值为阳性,则可以诊断并重新激活10-100倍;如果没有基线HBV DNA,可以诊断HBVDNA≥IU/mL;如果基线HBV DNA为阴性但转为阳,则可以诊断并重新激活[5,11,12]。 OBI和再激活的诊断涉及HBV DNA诊断试剂的检测下限。高灵敏度的HBV DNA试剂有助于准确诊断OBI,并有助于尽早诊断HBV再激活,减少再激活造成的危害。

4、今后需要更积极治疗乙肝启动抗病毒治疗的HBVDNA界定值趋于越来越低

今天的乙型肝炎治疗指南已将乙型肝炎肝硬化患者的治疗指征从之前的HBV DNA> 200 IU/mL扩展到“HBV DNA阳性”。

随着以恩替卡韦为代表的廉价,有效,低抗性口服药物的普及,可以进一步扩展抗病毒治疗的适应性患者群体。例如,如果感染HBV的患者出现持续性肝脏炎症(如ALT升高)并将肝炎排除在其他原因之外,现有指南建议HBV DNA> 2000 IU/mL(HBeAg阴性)或20,000 IU/mL(HBeAg阳性)开始抗病毒治疗。治疗[12],可能在未来更新的指南中,也是HBVDNA阳性,启动治疗,从而更早地控制病毒复制并降低肝硬化和肝细胞癌的发病率。此时还需要敏感的HBV DNA试剂。

5、核酸检测全自动化是趋势

目前的核酸检测技术在基于Taqman探针的实时定量技术中占主导地位(表3),但依赖于恒温扩增技术,如核酸序列扩增(NASBA),转录介导扩增(TMA)和数字微滴。放大技术(ddPCR)等,也具有一定的市场份额。每个技术平台都应该紧密符合临床和血站测试的日常需求。核酸提取,PCR和结果分析的全过程是核酸检测的必然趋势。具有自动化操作平台的品牌,完整的内部质量控制参数(如内部标准Ct值的严格定义,PCR扩增曲线的特定限制等)和严格的抗污染措施将在市场竞争中获得优势。

表3国内外常见HBVDNA试剂的灵敏度

[1] VirusResearch.2016,213: 205-13。

[2]肝脏,2019,24: 483-6。

[3] JHepatol.2019,doi: 10.1016/j.jhep.2019.03.034。

[4]中华预防医学杂志。 2019年,doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2019.05.002。

[5] Gastroenterology.2017,152: 1297-1309。

[6]中华检验医学杂志。 2009,32: 967-70。

[7] JHepatol.2010; 52: 475-7。

[8] JGastroenterol Hepatol。 2010,25: 1498-506。

[9] JHepatol.2019,70: 793-5。

[10]肠。 2019,68: 313-21。

[11] Gastroenterology.2015,148: 215-9。

[12]中华肝脏病杂志。 2015年,23: 888-905。

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